【腎細動脈とは】　腎臓は血液を濾過して尿を作り出す重要な臓器です。ヒトの二つの腎臓にはそれぞれ約１００万個（合計２００万個）の腎小体と呼ばれる濾過装置があります。腎小体は無数の小さい穴の空いた（有窓性）毛細血管の糸玉である糸球体とそれを包み込むボウマン嚢からできています（図１−１）。糸球体に流れ込む血液の量と濾過量はその入り口にある輸入細動脈と出口にある輸出細動脈という２種類の細動脈によって厳密に調節されています。

図１−１　腎小体と腎細動脈

【糸球体濾過】　ヒトの場合２つの腎臓には毎分1.25 Lの（循環血液量の25%）が流れ込み、糸球体毛細血管を通る間に腎血漿流量の20%が実際に濾過されます。正常なヒトの糸球体濾過量は成人男性ではおよそ170L/日（成人女性では140L/日）にもなります。

糸球体濾過量は一定に保たれるように厳密に調節されています。糸球体毛細血管内圧は糸球体濾過量を決める重要な因子です。運動などによって全身の血圧が上昇したときに、この毛細血管内圧も一緒に変化してしまうと糸球体濾過量を一定に保つことができません。そこで輸入細動脈には血圧の上昇を感知して収縮し、その下流の糸球体血管内圧を一定に保つ機能が備わっています。このような輸入細動脈の血圧依存的な収縮・弛緩は血管平滑筋に備わっている機能で、これを筋原性の自動調節と呼びます。

一方、腎血流量が何らかの理由で低下したときには、糸球体内圧を保つため出口側の血管、即ち輸出細動脈が収縮し糸球体濾過量を一定に保ちます。この調節にはレニン-アンジオテンシン系が関わっています。血流量の低下すると糸球体入り口に分布する顆粒細胞からレニンが分泌され、そのため血中アンジオテンシンII（血管収縮ペプチド）の濃度が上昇します。このアンジオテンシンIIが輸出細動脈を選択的に収縮させ、糸球体内圧を上昇させます。

この一例からも分かるように、糸球体毛細血管を挟んで一繋がりの動脈血管でありながら、２つの腎細動脈は異なる収縮制御を受けています。また、その収縮能力にも大きな違いがあります。

【腎細動脈の収縮特性】　血管収縮作動物質であるアンジオテンシンIIは輸入細動脈と輸出細動脈のどちらの細動脈も収縮させますが、その時引き起こされる収縮やその作用機序は異なります。水腎症ラットの腎臓を用いたを用いたin vitro還流系で腎細動脈に対するアンジオテンシンIIの効果を調べると、輸入細動脈は急速な収縮を示したのに対し、輸入細動脈はゆっくりと収縮しました（図１−２）。

図１−２　アンジオテンシンIIによる腎細動脈の収縮

また、単離した腎細動脈（図１−３）を用いて、Ca²⁺イオンの流入機構を調べてみると、輸入細動脈は電位依存性L型Ca²⁺チャネルからのCa²⁺イオンの流入がありましたが、輸出細動脈では筋小胞体内のCa²⁺イオン濃度に依存したCa²⁺流入（SOC: Store-Operated Calcium influx）が重要な役割を果たしていました。

図１−３　単離したラット腎細動脈 腎動脈からアガロースを還流後、ゲル化させ固定した腎細動脈をコラゲナーゼ等の酵素処理によりバラバラにし、顕微鏡下でマイクロマニピュレータを用いて単離しました。

このほかにも種々の血管収縮作動性物質に対する応答や、筋原性収縮に於いても、輸入細動脈と輸出細動脈は異なる収縮特性を示します。このように異なる収縮特性を生み出す分子機序を明らかにするため、遺伝子発現解析や調節タンパク質のリン酸化測定などの生化学的解析（後述）をカルガリー大学のDr. WalshとDr. Loutzenhiserと協力しながら行っています。

【リン酸化】 生体内で様々な働きをしているタンパク質はリン酸基の付加（リン酸化反応）などによって、その機能が制御されています。タンパク質のリン酸化は遺伝子発現・細胞周期調節・アポトーシス・細胞骨格形成・エネルギー代謝調節などに関わっています。だいたい３０％位のタンパク質がリン酸化によって何らかの制御を受けていると考えられています。

リン酸化反応はリン酸化酵素（キナーゼ）と脱リン酸化酵素（ホスファターゼ）によって可逆的に起こります。タンパク質中のセリン（Ser）、スレオニン（Thr）、チロシン（Thr）は特定のキナーゼによって必要なときにリン酸化されます。リン酸化されたタンパク質は、その活性が変化したり、細胞内での居場所が変化したりします。従って、機能を知りたいタンパク質のリン酸化状態を調べることで、たくさんの情報を知ることができます。

【平滑筋収縮・弛緩におけるリン酸化】 平滑筋の収縮・弛緩調節にもリン酸化反応が重要な役割を果たしています。平滑筋の収縮力を生み出すミオシンの活性はリン酸化によって制御されています（図２−１）。ミオシンはATPの加水分解エネルギーを機械運動に変換し、アクチンフィラメントを動かすモータータンパク質です。ミオシンの調節サブユニット（20 kDa調節軽鎖RLC、またはLC20）の19番目のSer残基がリン酸化されると、ミオシンのモーター活性が上昇し、アクチンの滑り運動が起こり、平滑筋は収縮します。逆にこれが脱リン酸化されると、ミオシンの活性は著しく低下し、平滑筋は弛緩します。

ミオシン以外にもリン酸化依存的に平滑筋収縮・弛緩調節に関わるタンパク質があります。ミオシン脱リン酸化酵素MLCPの脱リン酸化活性は、その調節サブユニットMYPT1のリン酸化によって制御されます。MYPT1のThr696とThr855がリン酸化されるとMLCPの活性は抑制され、平滑筋はより収縮しやすくなります。更に、MLCPの活性はCPI17と呼ばれるリン酸化依存性の阻害タンパク質によっても調節を受けます。ここにあげた以外にも様々なタンパク質のリン酸化が平滑筋の収縮・弛緩制御に関わっています。

図２−１　平滑筋収縮・弛緩調節モデル

【ミオシンのリン酸化測定】 平滑筋の収縮・弛緩制御機構を明らかにするためにはミオシンのリン酸化状態を調べることが第１歩となります。そのため様々なリン酸化測定の手法が開発されてきました。等電点電気泳動や二次元電気泳動、urea/glycerol電気泳動ではLC20をリン酸化状態によって分離することができるので絶対定量が可能です。また、放射性同位体標識³²P-ATPを用いた測定も広く行われてきました。しかし、これらの手法は多くの場合煩雑で、また感度が低かったり、組織標本に適用しにくいなどの欠点があり、微小な平滑筋組織（細い抵抗性血管平滑筋など）におけるミオシンのリン酸化状態を測定することができませんでした。

【Phos-tag SDS電気泳動】 微小平滑筋組織におけるミオシンのリン酸化状態を調べるためには、新規の高感度測定法を開発する事が必要でした。試行錯誤の結果、リン酸親和性タグ（Phos-tag）SDS電気泳動と高感度ウェスタンブロッティングを組み合わせることでピコグラム量のLC20（１平滑筋細胞に含まれるLC20は大雑把に１ピコグラム）をリン酸化状態に応じて分離・検出できるようになりました。

Phos-tag SDS電気泳動は広島大学のKinoshitaらが開発した手法で、リン酸基に親和性を持つMn²⁺-Phos-tagアクリルアミド（図２−２）を通常のSDS電気泳動ゲルに混ぜるだけで、タンパク質をリン酸化状態に応じて分けることのできる、きわめて簡便な手法です（参考WEBサイト）。リン酸基を持つタンパク質は泳動中、常にPhos-tagに捕捉されるため、リン酸基を持たないタンパク質よりゆっくりと泳動されます。LC20も非リン酸化LC20（0P-LC20）は通常のSDS電気泳動と同様分子量により他のタンパク質と分離されますが、リン酸化されたLC20（1P-LC20）は0P-LC20よりも遅れて泳動されます（図２−３）。

図２−２　Phos-tagアクリルアミド Phos-tagアクリルアミドに配位した２つのMn2+イオンがリン酸基に対して親和性を持っています。（参考WEBサイト）

図２−３　LC20のPhos-tag SDS電気泳動 Triton X-100で透過処理をしたラットの動脈を低Ca2+ (pCa 9)、高Ca2+ (pCa 4.5)、ホスファターゼ阻害剤(Microcystin)存在下でインキュベートし、Phos-tag SDS電気泳動で分析しました。(A)抗LC20抗体で全てのLC20を検出。非リン酸化(0P)、１重リン酸化(1P)、２重リン酸化(2P)LC20が観察されました。(B)抗リン酸化LC20抗体でリン酸化LC20だけを検出。上方２本のバンド（1Pと2P-LC20）だけが検出されました。

【その他の調節タンパク質のリン酸化分析】　平滑筋の収縮・弛緩調節にはミオシンLC20の他に様々なタンパク質のリン酸化が関わっているのは上述の通りです。それらのリン酸化タンパク質もPhos-tag SDS電気泳動を用いてリン酸化分析が可能なはずです。現在、我々はその可能性を検討しています。リン酸化依存的MLCP阻害タンパク質CPI17はPhos-tag SDS電気泳動で分離、定量ができることが分かりました（図２−４）。

図２−４　CPI17のPhos-tag SDS電気泳動 精製したCPI17をPKCでリン酸化して、Phos-tag SDS電気泳動で分析しました。